Eleonora, cea de-a doua fiică a lui Don Pedro Álvares de Toledo și a Maríei Osorio, s-a căsătorit prin procură cu Cosimo I de’ Medici pe 29 martie 1539, pe când avea doar șaptesprezece ani. Bărbatul, care era în căutarea unei soții care putea să-l ajute să-și consolideze poziția politică, a ales-o pe această tânără nobilă spaniolă, cunoscută pentru frumusețea ei. Eleonora avea părul castaniu și ochii căprui, avea chipul perfect oval și a devenit cea mai fascinantă soție ce intra în casa de’ Medici. Mireasa a sosit la Napoli în iunie, fiind însoțită de fratele ei, în aceeași zi au plecat spre Pisa, iar la jumătatea drumului l-a întâlnit pe Cosimo pentru prima dată.
După un scurt sejur la Pisa, cuplul a plecat spre Florența, iar mariajul s-a celebrat cu mare fast în Bazilica San Lorenzo. Tinerii au locuit inițial la Palazzo Medici Riccardi din via Larga, apoi s-au mutat la Palazzo Vechio, care a fost consolidat și mărit cu acea ocazie. Cei doi erau foarte îndrăgostiți unul de celălalt și, cât timp a trăit Eleonora, Cosimo nu a avut alte aventuri. Au avut 11 copii, dar mulți dintre ei au murit în copilărie sau adolescență de malarie sau tuberculoză.
Florentinii nu au iubit-o la început prea mult pe frumoasa ducesă, pentru că o considerau trufașă. Eleonora nu se deplasa niciodată pe jos prin oraș, ci doar călare sau într-o lectică îmbrăcată în satin verde în interior și în catifea în exterior. Stătea în spatele perdelelor, iar oamenii detestau faptul că nu o puteau vedea de aproape.
Totuși, în timp a câștigat o mare influență în Florența, iar prin faptele ei a arătat că îi pasă de popor: făcea daruri generoase și ajuta tinerele fără zestre să se căsătorească. Ducesa l-a sprijinit mult pe Cosimo în treburile politice, iar influența pe care o avea asupra soțului a fost recunoscută în întregul ducat. De multe ori, cei care nu reușeau să obțină o audiență la Cosimo, apelau la ea pentru a-i sprijini să-și pledeze cauza. Ducesa a fost cea care a insistat pentru cumpărarea Palazzo Pitti în 1549, iar reședința a devenit o adevărată comoară, deoarece generațiile care au urmat au adus aici picturi, sculpturi, bijuterii și alte obiecte de lux ale familiei.
Eleonora de Toledo a fost pictată împreună cu unul dintre fiii ei, Giovanni, de Agnolo Bronzino în 1545. Tabloul este considerat primul „portret de stat” ce reprezintă soția unui conducător împreună cu moștenitorul tronului și era destinat să demonstreze influența familiei de’ Medici. Ducesa iubea animalele domestice și avea un cățel, o pisică și un papagal. Pasiunea sa cea mare erau bijuteriile și hainele, dar îi plăceau și jocurile de noroc, pariurile, cursele de cai, călătorea mult, a încurajat artele și a fost patroana celor mai mari artiști ai epocii.
În perioada Renașterii italiene, dominată de strategiile politice ale marilor familii, mariajul Eleonorei a fost considerat inițial o alianță menită să consolideze poziția dinastiei Medici în Toscana și să o lege de influența spaniolă a viceregatului de Napoli. Totuși, corespondența păstrată în arhive arată că această uniune a depășit cadrul strict politic. În timp ce Cosimo își construia autoritatea printr-un regim centralizat și uneori dur, Eleonora a devenit un pilon discret al stabilității curții, administrând domeniile familiei, gestionând finanțele și intervenind în rețelele de patronaj artistic.
Eleonora a murit în 1562, în timpul unei călătorii. Plecase împreună cu Cosimo și trei dintre copiii lor, Giovanni, Garzia și Ferdinando, spre Maremma, de unde urmau să se îmbarce spre Spania pentru a-l vizita pe fiul lor cel mare, Francesco. În timpul unei opriri la Rosignano Marittimo, Giovanni și Garzia au făcut febră mare și au murit subit, iar după câteva zile ducesa s-a îmbolnăvit și ea și s-a stins din viață pe 17 decembrie, la Pisa. Mormântul ei se află in Bazilica San Lorenzo, în capela familiei de’ Medici.
