Isabella de’ Medici s-a născut pe 31 august 1542 la Florența, fiind fiica lui Cosimo I de’ Medici, primul Mare Duce de Toscana, și a Eleonorei di Toledo, cunoscută în epocă pentru frumusețea ei. Avea părul castaniu, ochi căprui și chipul de un oval perfect, fiind considerată cea mai fascinantă femeie din casa de’ Medici.
Împreună cu cei zece frați și surori, dintre care patru copii ilegitimi ai tatălui său, Isabella, a treia născută a familiei, a locuit mai întâi în Palazzo Vecchio și mai târziu la Palazzo Pitti, petrecându-și însă o mare parte din timp la Villa di Castello. Copiii de’ Medici au fost educați acasă de către tutori care i-au instruit în literatură, istorie, limbi străine și arte și, de la o vârstă fragedă, Isabella a arătat înclinație pentru muzică. Extrem de frumoasă, fetița avea un caracter pozitiv, era plină de viață, dar și impulsivă.
În 1553, la vârsta de 11 ani, copila a fost logodită cu Paolo Giordano Orsini, care avea 12 ani, și era moștenitorul ducatului de Bracciano din sudul Toscanei. Cei doi s-au căsătorit după cinci ani, în 1558, într-o ceremonie semi-privată, la Villa di Castello. Paolo a plecat foarte repede din casa socrului său pentru a-și îndeplini datoriile la Bracciano, dar Cosimo a decis să-și țină fiica lângă el și să păstreze în siguranță zestrea de 50.000 de scudi pe care i-o dăduse la nuntă. Totuși, i-a oferit frumoasei Isabella mai multă libertate decât aveau în mod obișnuit femeile florentine în epocă.
După moartea Eleonorei, mama sa, Isabella a preluat pentru o vreme rolul de primă doamnă a Florenței. Era vizitată des de Paolo, soțul ei, dar a suferit mai multe avorturi spontane și nu a dat naștere niciunui copil până la 20 de ani. Prima ei fiică, Francesca Eleonora, s-a născut în 1571, iar un an mai târziu s-a născut Virginio, fiul ce avea să moștenească ducatul tatălui său.
Stilul liberal al Isabellei a dus la apariția unor zvonuri cu privire la o relație cu Troilo Orsini, vărul soțului ei, care a fost acuzat că a avut excesiv de multă grijă de frumoasa ducesă în timp ce Giordano era ocupat cu îndatoririle militare.
Pe 16 iulie 1576 Isabella a murit pe neașteptate în timp ce se afla la Vila Medici din Cerreto Guidi, în timp ce familia își petrecea aici o vacanță. Potrivit fratelui ei, se pare că tragicul eveniment a avut loc dimineața, în timp ce își spăla părul. Tânăra a fost găsită de Paolo Giordano căzută în genunchi, ceea ce a dus la concluzia că murise de foarte puțin timp.
Versiunea aceasta a morții subite a Isabellei nu a fost crezută, iar ambasadorul Ercole Cortile a declarat că avea informații că Isabella fusese strangulată în după-amiaza precedentă chiar de către soțul ei, în prezența mai multor servitori.
Moartea frumoasei Isabella a fost cea de-a doua moarte suspectă petrecută într-o vilă izolată a familiei de’ Medici, după ce verișoara fetei, Leonora, murise în urma unui accident similar cu doar câteva zile înainte.
Mulți istorici cred că Paolo Giordano și-a ucis soția pentru că aflase că aceasta avusese o aventură cu Troilo Orsini. O altă variantă este că Giordano a acționat la indicațiile ducelui Francesco, unul dintre frații mai mari ai Isabellei. Tânăra ducesă avea doar 33 de ani și a fost înmormântată în capela familiei de’ Medici din Biserica San Lorenzo din Florența.
