Joséphine-Charlotte a venit pe lume pe 11 octombrie 1927, la Palatul Regal din Bruxelles, și a fost fiica cea mare a regelui Leopold al III-lea al Belgiei și a primei lui soții, Astrid a Suediei. Copila a fost botezată la o lună după naștere, nașul ei fiind prințul Charles, Conte de Flandra, iar nașă i-a fost viitoarea soacra, Marea Ducesă Charlotte de Luxemburg.
În timp ce era însărcinată, regina Astrid citise o biografie a împărătesei Franței, Joséphine de Beauharnais, și, impresionată de viața acesteia, i-a dat micuței numele ei. Suverana Belgiei a fost murit într-un tragic accident de automobil în 1935, când copila avea aproape opt ani, iar opinia publică belgiană, care o prețuia nespus, și-a extins simpatia asupra familiei îndurerate, fiind îngrijorată de efectele pe care dispariția prematură a mamei le-au avut asupra Joséphinei-Charlotte și a fraților ei.
Mai târziu, în 1941, regele Leopold s-a recăsătorit cu Mary Lilian Baels, devenită mai târziu Prințesă de Réthy, iar din această căsătorie au rezultat trei copii: Alexandre, Marie-Christine și Marie-Esméralda. Joséphine-Charlotte și frații ei au avut o relație bună cu noua soție a tatălui și au numit-o “Mamă”.
Copila a urmat școala la Palatul Regal, unde a fost organizată o clasă cu eleve de aceeași vârstă pentru ea, iar la sfârșitul anului 1940 a fost înscrisă la internatul unei școli catolice din Bruxelles, unde a studiat până în 1942, apoi și-a continuat educația cu profesori privați la reședința din Laeken, unde familia a fost ținută prizonieră în timpul războiului. Pe 7 iunie 1944, a doua zi după ce Forțele Aliate au debarcat în Normandia, ea și tatăl ei au fost trimiși în Germania, în arest la domiciliu. Familia regală (inclusiv frații Baudouin și Albert, fratele vitreg, Alexandre, și Prințesa Lilian) a fost eliberată pe 7 mai 1945, ulterior stabilindu-se la Prégny, în Elveția, până în 1950.
Joséphine-Charlotte și-a continuat studiile la École Supérieure de Jeunes Filles din Geneva, unde a urmat cursuri de literatură franceză, engleză, istorie și chimie și a asistat la prelegerile lui Jean Piaget despre psihologia copilului.
Pe 11 aprilie 1949, prințesa s-a întors în Belgia, a vizitat Primăria Bastogne, Memorialul de război și Memorialul Mardasson, apoi a ajuns la Palatul Regal din Laeken împreună cu bunica ei, regina Elisabeta. Joséphine-Charlotte l-a întâlnit pentru prima dată pe Jean, Marele Duce de Luxemburg, în timpul uneia dintre scurtele ei vizite la nașa și viitoarea ei soacră, Marea Ducesă Charlotte, la Fischbach, în 1948. Pe 26 decembrie 1952, cuplul și-a anunțat logodna, iar nunta a avut loc pe 9 aprilie 1953, la Luxemburg. Cei doi au avut, în cei 52 de ani de mariaj, cinci copii: Marie-Astrid, Henri, Mare Duce de Luxemburg, Prințul Jean de Luxemburg, prințesa Margaretha și prințul Guillaume de Luxemburg.
Prințesa a adus o aer de eleganță, bun gust și rafinament în noua ei țară, și-a îndeplinit cu mult devotament sarcinile sociale, s-a implicat în munca filantropică și s-a concentrat pe problemele legate de sănătatea copiilor și bunăstarea familiilor din regat.
Ca Mare Ducesă, și-a însoțit frecvent soțul în vizite în străinătate, mergând la Vatican și Brazilia în 1965, în Regatul Unit în 1972, în URSS și Tunisia în 1975, Senegal în 1977, China în 1979 și Statele Unite în 1984.
Joséphine-Charlotte a devenit președintă a Crucii Roșii luxemburgheze în 1964 și apoi președintă de onoare al Orchestrei Filarmonicii, patroana Uniunii Donatorilor Voluntari de Sânge și a Societății Naționale de Pediatrie, vizitând în mod regulat centrele de caritate și culturale, spitalele și creșele sociale.
Marea Ducesă, care suferea de mult timp de cancer pulmonar, s-a stins din viață la Castelul Fischbach pe 10 ianuarie 2005, la vârsta de 77 de ani.
